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Rockland:熒光WB封閉劑

發布者:艾美捷科技    發布時間:2022-08-12     
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封閉的原理:

固相載體表面(如Elisa板,NC膜或者PVDF膜上等)有很多孔洞,通過電轉或包被,膠上的蛋白被轉移到了膜上,或抗原/抗體固定在了板上,蛋白以機械填補(堆積)和吸附的方式結合于表面。蛋白塞進了表面的很多孔洞里面,但蛋白覆蓋并不是連續的,有很多空隙,而且樣品孔之間也有空隙,這些孔洞并沒有填進東西,而抗體也是蛋白,也會被吸附在空的洞里,這樣就會有很多非特異性的信號。   封閉液中的蛋白可以與固相載體表面上的空白空洞位置結合,同樣以機械填補(堆積)和吸附覆蓋的方式結合在膜上,因為有“填補”和“覆蓋”蛋白結合位點以避免一抗的非特異結合,所以有“封閉”的說法。同樣這兩種作用使封閉液中的蛋白能夠很牢固的結合在空白位置上。這樣抗體蛋白就不會被非特異性的吸附到膜上,而只會跟特異性蛋白結合。


封閉劑的種類及選擇依據:

封閉劑應封閉所有的未結合位點而不替換表面上的靶蛋白、不結合靶蛋白表位、也不與抗體或檢測試劑有交叉反應。常見的封閉劑主要有以下幾種:  


1、BSA

BSA是最常用的封閉劑,成分單一適用于大多數情況。若免疫原是偶聯BSA的, BSA有很強的免疫原性,會導致產生很多的針對BSA的抗體,為避免交叉反應,不能用BSA、脫脂奶粉等封閉,可以選用酪蛋白或無蛋白的封閉劑封閉。 大部分BSA中有少量的抗體殘留,會導致抗原/抗體之間的交叉反應,產生高背景,雜帶較多或使得本底水平增高。  

2、正常血清

封閉血清的原理主要有兩點,第一是待檢樣本會有些與蛋白非特異性結合的物質,從而導致背景過高,因此可以用BSA或血清封閉掉這部分非特異性的結合,從這點看,BSA和血清沒有明顯區別。第二是待檢樣本中可能會有Fc受體,可以和抗體恒定區結合,與抗體特異性無關,封閉血清中有抗體,因此用血清可以封閉掉一抗及二抗和樣本Fc受體之間結合。BSA則無法封閉Fc受體。 免疫組化中用血清封閉的較多。封閉血清一般選擇和二抗同一來源的,血清中動物自身的抗體,預先能和組織中有交叉反應的位點發生結合,否則在后面的步驟中如果和二抗發生結合, 會造成背景。但要注意封閉用血清中不能含有目標蛋白,且與一抗來源不同。另外二抗因盡量少選取兔子或小鼠來源的,因為這兩個在親緣關系上和人類非常接近,所以產生交叉反應的機會就比較大,從而導致背景比較高。適合選用來源于驢,山羊,綿羊等的二抗,背景相對就很低。  

3、脫脂奶粉

脫脂奶粉最大的優點是價格便宜,但是由于成分相對復雜,所以適用范圍要狹窄一些。磷酸化抗體也許會導致背景增加,此外,因為自身含有生物素,不能用于生物素標記的抗體系統。 奶粉蛋白種類比BSA多,而WB膜也好,ELISA板也好,表面的微結構都不是那么均勻的,相對而言,不同分子量蛋白種類多的奶粉(BSA只是一種蛋白),封閉起來更全面。 脫脂奶粉中含有少量的生物素和堿性磷酸酶殘留,在使用生物素-親和素系統和堿性磷酸酶標記的二抗時,也會使得高背景或本底水平增高。 由于奶粉的成份復雜,而且封閉后的載體不易長期保存,因此在試劑盒的制備中較少應用。  

4、酪蛋白

和BSA作用類似,普通酪蛋白不易溶解。中性和堿性條件下帶有負電性,與同樣帶負電荷膠體金之間存在排斥力,而膜一般都是帶正電荷,會與酪蛋白有一定的吸附作用,用酪蛋白封閉效果好些。    


常規的封閉劑各有優劣,沒有任何一種封閉劑能適合所有的實驗,今天給大家帶來一款知名免疫試劑供應商Rockland生產的,總體效果顯著優于傳統的像BSA(牛血清白蛋白)、脫脂奶粉、酪蛋白(Casein)等的封閉劑,他在熒光WB和蛋白芯片微陣列應用中表現不俗,同時也可以用于Elisa,IHC/IF等應用~ 


熒光WB封閉劑推薦:


熒光WB封閉劑


貨號名稱規格應用類型
MB-070Blocking Buffer for Fluorescent Western Blotting 熒光WB封閉緩沖液500mlWB,ELISA,IF,IHC,IP,Microarray(微陣列)


MB-070用于PEPperCHIP? 肽微陣列的封閉,顯示出顯著優于其他常規封閉劑的性能:


不同封閉劑在使用 PEPperCHIP? 肽微陣列進行表位定位時的性能比較

不同封閉劑在使用 PEPperCHIP? 肽微陣列進行表位定位時的性能比較:用 2% 脫脂奶粉 (A)、1% HSA (B)、1% BSA (C) 或 100% Rockland 封閉緩沖液 (D) 封閉 PEPperCHIP?肽微陣列30分鐘。以1:200的稀釋度測定人血清樣品,然后用山羊抗人 IgG (H+L) DyLight 680 二抗和對照抗 HA (12CA5)-DyLight 800 抗體進行檢測。


其他封閉劑推薦:


貨號名稱圖片/應用背景
MB-064-0100ELISA Microwell Blocking Buffer with Stabilizer(適用于包被完抗原/抗體后的Elisa 96孔板的封閉及穩定保存)

適用于包被完抗原/抗體后的Elisa 96孔板的封閉及穩定保存

BSA-50Bovine Serum Albumin - Fraction V(BSA)

BSA

B304Normal Goat Serum(正常山羊血清)

正常山羊血清

MB-067-0100

MB-066-0100 

MB-065-0100

TBS Fish Gel Concentrate 10X PBS Fish Gel Concentrate 10X BBS Fish Gel 10X (魚膠)用魚膠當封閉液是從豬皮膠演變而來的。魚膠是從冷水魚的皮膚中提取出來的,即使在溫度較低的情況下也會不會凝固。通常使用的濃度為0.1-5% (w/v)。不像脫脂奶粉和BSA,它不含有任何的血清蛋白,所以就不會和哺乳動物抗體產生交叉反應,大大降低了背景信號。但是魚膠不能用來封閉生物素-抗生物素抗體蛋白系統,因為它含有內源性生物素。
K505Blocking Buffer Sampler Kit(是包含正常山羊血清,BSA,MB-070,MB-064-0100和MB-067-0100的套裝)

正常山羊血清

MB-070-010TFBlocking Buffer For Immunohistochemistry Serum And Azide Free(IHC專用封閉劑)

IHC專用封閉劑


以上產品僅用于科研,不能用于醫療診斷~  


MB-070的引文(截至目前收錄的引文共138篇,篇幅有限僅展示5篇):

Rieger AC et al. Growth hormone-releasing hormone agonists ameliorate chronic kidney disease-induced heart failure with preserved ejection fraction. Proc Natl Acad Sci USA. (2021) 

van der Weegen Y, Golan-Berman H, Mevissen TET, et al. The cooperative action of CSB, CSA, and UVSSA target TFIIH to DNA damage-stalled RNA polymerase II. Nat Commun. (2020) 

Werner CT et al. Neuroadaptations in the dorsal hippocampus underlie cocaine seeking during prolonged abstinence. Proc Natl Acad Sci USA (2020) 

Spence et al. In vivo proximity proteomics of nascent synapses reveals a novel regulator of cytoskeleton-mediated synaptic maturation. Nature Communications (2019) 

Lombardi AA, Gibb AA, Arif E, et al. Mitochondrial calcium exchange links metabolism with the epigenome to control cellular differentiation. Nat Commun. (2019)   


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